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利用显微拉曼光谱和可调式阻性脉冲感应(TRPS)组合方法测量细胞外泌体的尺寸、浓度和种类

利用显微拉曼光谱和可调式阻性脉冲感应(TRPS)组合方法测量细胞外泌体的尺寸、浓度和种类
 

利用显微拉曼光谱和可调式阻性脉冲感应(TRPS)组合方法测量细胞外泌体的尺寸、浓度和种类
 

简介
 
细胞会释放囊泡,例如外泌体和微泡。这些由双层磷脂包裹的球状微粒比人体内*小的细胞还要再小100倍。

图1. 人类尿液内囊泡的电镜图像
 
 
图1显示了投射电镜下人类尿液里的囊泡。由于细胞会把囊泡释放到周围环境和体液中,故血液,唾液和尿液当中都含有大量的细胞产生的囊泡。
 
细胞利用囊泡来排出废弃物及运输物质,例如把受体和基因信息运输到其他细胞。既然所运输的物质允许囊泡对特定的细胞传输信息,那么囊泡自然在细胞间的通信中扮演了关键的角色。此外,体液中的囊泡,其尺寸,浓度,细胞源及组分会随着疾病而产生变化。比如,血浆中囊泡数量的增加通常与血栓和转移癌症有关。囊泡的功能以及它们在病症期间性质的变化表明了囊泡有很多临床的应用。比如特定种类囊泡数量的剧增可能预示着某种疾病的出现。获得这些信息对病症的诊断和监视治疗效果有着很大的帮助。
 
此外,囊泡可以用来将药物直接送到患病器官处而又不会被人体的免疫系统清除掉。为了使这些应用成为现实,我们需要一种能对囊泡种类进行鉴别,并对囊泡的尺寸和浓度进行检测的仪器。
 
方法
 
图2.可调阻性脉冲感应(TRPS)示意图 – 与纤维拉曼光谱混合
 
为了检测出特定种类囊泡的尺寸和浓度,使用可调阻性脉冲感应(TRPS)与纤维拉曼光谱联合测试的方法。 图2为这种方法的示意图。TRPS由两种液体单元组成,被一层不导电的绝缘膜隔开。电流通过绝缘膜上的单个小孔流动,小孔直径小于1um。电流的变化与囊泡量近似成正比关系。通过在两个液体单元之间施加不同的压力,由压力驱动的液体流动作用比电泳电渗和扩散效应带来的液体流动要更强,因此压力驱动的流动占主要地位。系统由已知尺寸和浓度的液珠进行校正,所以囊泡的计数率就跟囊泡的尺寸和浓度相关了。所以,TRPS可以用来检测囊泡尺寸的分布和悬浮液内的囊泡浓度。
 
囊泡通过膜上小孔后,会被785nm激光光束的光镊效应俘获。囊泡的斯托克斯拉曼散射被光谱仪收集(),每一种细胞的囊泡都有其特征的拉曼光谱,因而,拉曼光谱很可能也包含了囊泡的细胞源信息。
 
拉曼光谱法的优势在于:
1、可量化;
2、无需标记。
相比之下,绝大多数实验室使用荧光抗体标记的方法来鉴定囊泡,这种方法既费事又会引入其他问题,如抗体通常不仅会跟抗原结合,还会跟Fc受体结合。
 
测试结果
 
图3.尿液囊的尺寸分布以及浓度
 
我们改进了TRPS系统上层液体,(Izon Science Ltd, Christchurch, New Zealand) 使膜孔有了光学延展性。改进之后,我们评估了TRPS检测人体尿液囊泡的尺寸和浓度。之所以选择尿液囊泡,是因为尿液里含有较高浓度的尿液囊泡,同时脂蛋白和蛋白质集结的污染程度较小。图3显示了用TRPS测量的尿液囊泡的尺寸分布以及浓度,尿液囊泡的浓度随着尺寸的增加而降低,我们能检测到的*小尺度的尿囊为100nm直径
 
图4.单血小板源性囊泡的拉曼光谱图。拉曼峰表征了出现在这种囊泡内的特征化学成分
 
TRPS的显微扩展使激光可以聚焦到小孔上,并用光镊的方法俘获单个囊泡,从而获取单个囊泡的拉曼光谱。图4为单血小板源性囊泡的拉曼光谱图。拉曼峰表征了出现在这种囊泡内的特征化学成分。
 
结论和展望
体液包含源于细胞而存在于细胞外的囊泡,包含了有用的临床信息。在生理病理学条件下研究这些囊泡的作用,并将囊泡运用于疾病的生物标记。我们研发了一种新型的TRPS-拉曼的联合应用使得我们可以通过TRPS检测到百纳米量级的囊泡,并对单个血小板源性囊泡的拉曼光谱进行了采集,下一步我们还将这种方法应用去其他种类囊泡的研究。